Выращивание клеток и тканей на питательных средах


Методы и условия культивирования изолированных тканей и клеток организмов.

Выращивание изолированных клеток и тканей на искусствен­ных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) получи­ло название метода культуры изолированных тканей.

В связи с тем, что в жизни человека наибольшее значение име­ют семенные растения, методы и условия для их культивирова­ния разработаны лучше, чем для голосеменных растений или во­дорослей, выращивание которых в стерильных условиях вызывает определенные затруднения. Однако, независимо от принадлежнос­ти растений к той или иной таксономической группе, существуют общие требования к выращиванию объектов в культуре in vitro.

Асептика. Прежде всего, культивирование фрагментов ткани или органа растения — эксплантов, а тем более отдельных клеток тре­бует соблюдения полной асептики. Микроорганизмы, которые мо­гут попасть в питательную среду, выделяют токсины, ингибирующие рост клеток и приводящие культуру к гибели, поэтому при всех манипуляциях с клетками и тканями при культивировании in vitro соблюдают определенные правила асептики.

Питательные среды. Изолированные клетки и ткани культиви­руют на многокомпонентных питательных средах. Они могут су­щественно различаться по своему составу, однако, в состав всех сред обязательно входят необходимые растениям макро- и мик­роэлементы, углеводы, витамины, фитогормоны и их синтети­ческие аналоги. Углеводы (обычно это сахароза или глюкоза) вхо­дят в состав любой питательной смеси в концентрации 2—3%. Они необходимы в качестве питательного компонента, так как большинство каллусных тканей лишено хлорофилла и не способ­но к автотрофному питанию. Поэтому их выращивают в условиях рассеянного освещения или в темноте. Обязательными компонентами питательных сред должны быть ауксины, вызывающие дедифференцировку клеток экспланта, и цитокинины, индуцирующие клеточные деления. При изменении соотношения между этими фитогормонами или при добавлении других фитогормонов могут быть вызваны разные типы морфогенеза.

Физические факторы. На рост и развитие растительных тканей in vitro большое влияние оказывают физические факторы — свет, температура, аэрация, влажность. Большинство каллусных тканей могут расти в условиях слабого освещения или в темноте, так как они не способны фотосинтезировать. Вместе с тем свет может выступать как фактор, обеспечивающий морфогенез и активирующий процессы вторичного синтеза. Для большинства каллусных культур оптимальна температура 26 °С. Для выращивания суспензионных культур большое значение имеет аэрация. Особенно важно снабжение воздухом куль­тивируемых клеток в больших объемах ферментеров. Оптимальная влажность в помещении, где растут культуры, должна составлять 60—70%. Таким образом, культивирование клеток и тканей зависит от мно­гих факторов внешней среды, и действие их не всегда хорошо изве­стно. Поэтому при введении в культуру нового вида растений необ­ходимо прежде всего тщательно изучить влияние физических фак­торов на рост и физиологические характеристики этой культуры.

Предыдущая123456789Следующая

Дата добавления: 2016-06-02; просмотров: 1028; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

ПОСМОТРЕТЬ ЕЩЕ:

helpiks.org

Методы культивирования клеток и тканей

В условиях лаборатории можно культивировать самые разнообразные клетки одноклеточных и многоклеточных организмов, что совершенно необходимо для решения целого ряда цитологических проблем.

Культивирование клеток и тканей вне организма (in vitro) связано с соблюдением определенных условий, необходимых для роста и развития этих культур. Прежде всего требуется подходящая для каждого вида культур посуда. Так, культуры бактерий и простейших обычно содержатся в пробирках, чашках Петри и Коха, в стеклянных флаконах, микроаквариумах. Предметные стекла с углублениями (лунками), чашки и флаконы Карреля используются. Для культур тканей многоклеточных организмов. Выращивание культур производится на минеральных и питательных средах, состав которых различен для отдельных видов бактерий, простейших, а также для клеток и тканей многоклеточных животных и растений. Культуры бактерий успешно растут в жидких, в полужидких и на плотных питательных средах. Большое разнообразие культуральных сред известно и для простейших. Например, инфузория-туфелька -- обычный объект для многих цитологических работ - хорошо культивируется на сенном настое, настое салата, на минеральной среде Л.К. Лозина-Лозинского с постоянной подкормкой бактериями и дрожжами. Культуры амеб (Amoeba proteus) выращиваются на минеральной среде Прескотта с кормлением их мелкими инфузориями тетрахименами, а для культур разнообразных паразитических простейших существует много видов специальных сред, часто имеющих сложный состав.

Сложность состава характеризуется и большинство сред, используемых для выращивания тканевых культур. Например, синтетическая среда 199, наиболее широко применяемая сейчас для культивирования самых различных тканей, содержит свыше 60 компонентой (аминокислоты, витамины, источники липидов, компоненты нуклеиновых кислот и прочие вещества).

Культуры бактерий, простейших и тканевые культуры выращиваются при определенной температуре. Если кусочки тканей взяты от теплокровных животных, то тканевые культуры содержатся при 37° С. При этой же температуре культивируются многочисленные виды бактерий и паразитических простейших, живущих в организме человека и теплокровных животных. Свободноживущие простейшие, паразитические простейшие из холоднокровных животных, а также клетки растений можно успешно выращивать при комнатной температуре.

Вся посуда, инструменты, все минеральные и питательные среды, используемые для культур, должны быть стерильными. Загрязнение культур какими-либо посторонними частицами и бактериями из воды, воздуха и т. п. совершенно недопустимо. В относительно нестерильных условиях содержатся только культуры свободноживущих простейших. Однако в последнее время получен ряд культур инфузорий и жгутиконосцев, которые носят название безбактериальных и требуют не меньших условий стерильности, чем тканевые культуры.

Еще одно необходимое условие для поддержания любой культуры - это регулярные пересевы на свежую питательную среду. При условиях регулярных пересевов культуры бактерий, простейших и тканевые культуры могут существовать в течение многих лет.

Целый ряд цитологических исследований необходимо проводить на генетически однородном материале. С целью получения таких генетически однородных культур широко используется выведение клонов (клоновые культуры), представляющих потомство одной особи бактерий, простейших пли одной клетки какой-либо ткани.

Методы культивирования бактерий и простейших относительно просты; наибольшей сложностью характеризуются методы культивирования тканей. Среди них различаются культуры кусочков органов, кусочков тканей и отдельных клеток, выделенных из многоклеточного организма. Методика культивирования кусочков тканей разнообразна, но наиболее широко распространено культивирование в висячей капле и в чашке или флаконе Карреля.

В последнее время хорошо разработаны методы получения однослойных клеточных культур. Для таких культур небольшое количество клеток, полученных путем специальной обработки кусочков тканей, переносят в сосуды для культивирования и добавляют туда питательную среду. Клетки через небольшой промежуток времени прикрепляются к дну и стенкам сосуда, а затем начинают интенсивно размножаться, располагаясь в один слой. К настоящему времени получено несколько десятков клеточных штаммов, ведущих свое начало от разных тканей: соединительной, эпителиальной и др. Культуры таких клеток обладают определенными свойствами, сохраняющимися на протяжении многих клеточных поколений. Клетки из этих однослойных культур хорошо изучены, для них разработаны стандартные условия культивирования, и они представляют очень ценный материал при изучении клеточного обмена, потребностей клеток в тех или иных веществах, для исследований клеточных ядер, для прижизненных наблюдений и т. д.

4. Методы исследования биоэлектрических явлений в клетке.

Биоэлектрические потенциалы или электрические напряжения в тканях и клетках животных и растений могут быть измерены и засняты на движущуюся фотопленку. Для отведения биоэлектрических потенциалов из клетки пользуются двумя методами:

1) внутриклеточное отведение с помощью микроэлектродов;

2) внеклеточное отведение с использованием наружных электродов. Рассмотрим кратко оба эти метода.

Микроэлектроды, которые используются для внутриклеточного отведения электрических потенциалов,-- это микропипетки из стекла, заполненные раствором соли -- электролитом (2,5-3 М КCI). Кончик микроэлектрода, вводящийся в клетку, очень тонкий; его диаметр меньше 1 мк. Микроэлектроды вводятся в клетку при помощи микроманипулятора. Противоположный конец микроэлектрода соединяется со стеклянной трубочкой, заполненной агар-агаром желеобразной консистенции (агар-агар приготовлен на растворе Рингера). Стеклянная трубочка, в свою очередь, соединяется с неполяризующимся хлорсеребряным или каломельным электродом, а последний -- с регистрирующим устройством. Второй электрод (наружный) помещается во внешнюю среду, которая окружает клетку. Это стеклянная трубочка, заполненная солевым раствором. Она соединяется одним концом с неполяризующимся электродом, а последний -- с регистрирующим устройством.

Для внеклеточного отведения биопотенциалов к наружной поверхности клеток прикладываются два электрода. Это либо стеклянные трубочки, наполненные раствором Рингера, либо металлические проволочки (серебряные или платиновые). Они соединяются с неполяризующимися хлорсеребряными или каломельными электродами, а они, в свою очередь, с регистрирующим устройством.

Измерение биоэлектрических потенциалов можно производить как на клетках различных тканей многоклеточных организмов, так и на клетках простейших. Метод внутриклеточного отведения с применением микроэлектродов используется главным образом для регистрации разницы потенциалов, которая существует между клеткой и окружающей средой (потенциалы покоя). Внеклеточное отведение позволяет также регистрировать потенциалы, возникающие при повреждении и возбуждении (потенциалы повреждения и возбуждения). В целом же регистрация электрических процессов в клетках, тканях и органах - важный метод характеристики их функционального состояния.

5. Методы исследования физико-химических свойств клетки:

1. О вязкости клеточного содержимого, которое дает представление об агрегатном состоянии цитоплазмы и ядра, можно судить по скорости падения зерен крахмала в цитоплазме некоторых растительных клеток, по скорости перемещения ядрышка под влиянием силы тяжести, по скорости перемещения капельки масла, введенной в нервное или мышечное волокно, по скорости перемещения металлической частицы, введенной в клетку в магнитном поле, и по броуновскому движению, обычно наблюдаемому во многих растительных и животных клетках.

2. Измерение удельного веса клетки осуществляется путем подбора жидкости, не оказывающей токсического действия и с удельным весом, равным таковому клетки. Для этой цели пригодны, например, растворы гуммиарабика различной концентрации. Клетки помещаются в такую жидкость и центрифугируются. Удельный вес клеток и жидкости совпадает тогда, когда клетки не перемещаются при центрифугировании в этой жидкости. Таким же способом измеряется удельный вес изолированных ядер и органоидов клетки.

3. Определение показателя преломления клеток производится путем погружения клеток в индифферентные жидкости, обладающие разными показателями преломления. Когда показатели преломления клеток и среды совпадают, контуры клетки становятся невидимыми при наблюдении в фазово-контрастный микроскоп. Второй метод измерения показателя преломления основан на наблюдении клеток в интерференционном микроскопе. При этом по специальным формулам вычисляется отставание по фазе световой волны, прошедшей через клетку, по сравнению со световой волной, прошедшей вне клетки.

4. Определение внутриклеточного рН можно произвести путем прижизненного окрашивания клеток красителями, обладающими свойствами индикаторов (нейтральный красный, бромкрезиловый синий). В крупных клетках, например в гигантском нервном волокне, мышечном волокне, в крупных растительных клетках, рН определяется электрометрическим методом с применением микроэлектродов.

К этой же группе методов относится измерение электрического заряда поверхности клетки, измерение поверхностного натяжения и изоэлектрической точки клеток и др. Важно, чтобы определение всех перечисленных физико-химических свойств проводилось на живых, неповрежденных клетках.

studopedia.su

Культура изолированных тканей

Методы выращивания изолированных тканей растений были разработаны Ф. Уайтом и Р. Готре. Сущность метода заключается в том, что выделенные ку­сочки ткани или отдельные клетки выращивают на искусственной питательной среде в стерильных условиях. Если полностью дифференцированную клетку изолировать, то в стерильных условиях на соответствующей питательной среде она снова начинает делиться, и затем из нее может развиться целый растительный организм. Так, из одной полностью дифференцированной клетки флоэмы, выделенной из корнеплода моркови, из клетки сердцевинной паренхимы табака и других можно получить целое, полностью развившееся растение. В опытах Р.Г. Бутенко с клетками фло­эмы моркови при выращивании на питательной среде в стерильных условиях сначала клетки быстро делились. Получалась недифференцированная масса мелких клеток — каллюс меристематической структуры (увеличенное число рибосом, митохондрий и т. д.) с интенсивным синтезом РНК и белка. При этом возрастала интенсивность дыхания и увеличивалась доля пентозофосфатного пути. Затем в массе однородных клеток возникали очаги дифференциации, клет­ки дифференцировались вторично. Процесс вторичной дифференцировки можно разделить на две фазы. Первая фаза — это образование в массе однородных клеток очагов регенерационной меристемы и возникновение зародышевых структур (эмбриоидов), которые на­поминают настоящие и имеют зачаточную почечку и зачаточный корешок. На второй фазе происходит рост этих зародышевых структур. При этом в зависи­мости от соотношения фитогормонов (ауксинов и цитокининов) происходит преимущественный рост тех или иных органов. В настоящее время ведутся исследования с изолированными протопластами, которые выделяют путем раз­рушения клеточных стенок специальными ферментами. Изолированные про­топласты при помещении их на подходящую питательную среду образуют но­вую оболочку, т. е. превращаются в клетки. Вместе с тем протопласты способны сливаться вежду собой и образовывать клеточную оболочку. Таким образом, можно получить гибридную клетку, а из нее растение. Рост и дифференциация и в этом случае зависят от соотношения физических и гормональных веществ в питательной среде. Метод выращивания изолированных тканей, клеток, протопластов позволя­ет решать многие теоретические вопросы, связанные с раскрытием механизмов дифференцировки (морфогенеза), регуляции физиологических процессов и др. Этот метод получил также широкое практическое применение в области сель­ского хозяйства, биотехнологической промышленности.

Биотехнология — наука, использующая биологические принципы в практиче­ских целях. Эта отрасль науки охватывает очень широкий круг вопросов. Ряд из них решается с помощью клеточных культур. Так, все более важное значение приобретает клональное размножение. Клон — ряд поколений генетически одно­родных потомков одной исходной особи, образующейся в результате бесполого размножения. Клонирование позволяет получать большое количество поса­дочного материала, полностью идентичного исходной особи. При клональном микроразмножении в большинстве случаев в качестве ис­ходного материала используются фрагменты верхушечной апикальной мери­стемы. Верхушечные меристемы не содержат патогенных микроорганизмов, поэтому растения, полученные от них, являются здоровыми. Изолированные меристемы выращивают в стерильных условиях на ряде последовательно меняю­щихся питательных сред. В результате получаются растения с корневой системой, пригодные для посадки в почву. Этим методом от клеток меристемы одного растения можно получить практически неограниченное число потомков. Ме­тод широко применяется для размножения декоративных, ягодных и других растений. Все большее значение в селекции приобретает метод изолированных клеток. Здесь возможны разные направления: направленный отбор клеток, ока­завшихся устойчивыми к тем или иным неблагоприятным условиям среды или болезням, и выращивание из них устойчивых растений (клеточная селекция). Важное значение имеет получение гаплоидных растений, содержащих одинар­ный набор хромосом. Этот метод предполагает получение растений из мужских либо из женских гамет. Гаплоидные растения после обработки колхицином имеют два набора идентичных хромосом, полностью соответствующих материнскому рас­тению. Большие надежды возлагаются на соматическую гибридизацию, заключаю­щуюся в слиянии двух протопластов. Таким путем были получены гибриды между картофелем и томатами, названные «помато». Преимущества такой гибридизации заключаются в том, что наследуются признаки, не только закодированные в ядре, но и в органеллах цитоплазмы. Следовательно, можно управлять такими важными процессами, как фотосинтез, дыхание и др. Наконец, нельзя не отметить широкое использование культуры изолированных тканей для промышленного получения ряда важнейших лекарственных и пищевых препаратов. В качестве примера мож­но привести получение тонизирующих веществ из клеток женьшеня, стероидных сапонинов из клеток дискореи дельфитовидной и др.

Необходимо в заключение отметить, что для всех направлений применения метода изолированных тканей необходимо знание физиологических особенно­стей используемого объекта. Из опытов с культурой изолированных тканей, кле­ток и протопластов можно сделать несколько выводов:

1. Все клетки действительно имеют одинаковые потенциальные возможности.

2. Клетка, находящаяся в окружении других клеток, и клетка, выделенная из ткани, проявляют эти возможности по-разному.

3. Проявление потенциальных возможностей клеток определяется внутрен­ними и внешними условиями. Большое значение имеют гормоны.

4. В основе регуляции дифференциации клетки лежит дифференциальная ак­тивность генома.

5. Не все клетки могут полностью проявить свои возможности. В некоторых случаях гены настолько репрессированы, что эти возможности не проявляются. В процессе развития клетка может также потерять способность реализовать имеющуюся информацию.

 

fizrast.ru

Техника введения в культуру in vitro и культивирование изолированных клеток и тканей растений - Справочник химика 21

Необходимым условием работы с культурой изолированных тканей является соблюдение строгой стерильности. Богатая питательная среда является прекрасным субстратом для развития в ней микроорганизмов, а изолированные от растения фрагменты (экспланты), которые помещают на питательную среду, легко поражаются микроорганизмами. Поэтому надо стерилизовать как эксплант, так и питательную среду. Все манипуляции с изолированными тканями (введение в культуру, пересадка на свежую питательную среду) проводят в асептическом помещении (лами-нар-боксе) стерильными инструментами. Стерильность надо соблюдать и во время культивирования изолированных тканей, особенно при перепаде температуры и влажности, так как при этом пробки становятся влажными и по ним в пробирку могут проникать микроорганизмы. [c.80] Стерилизацию экспланта и семян проводят выдерживая их 5—20 мин в стерилизующих растворах с последующей многократной промывкой экспланта стерильной водой. Время стерилизации зависит от характера экспланта и от стерилизующей активности раствора. Семена стерилизуют 10—20 мин, а вегетативные части 5—10 мин. Примеры стерилизующих растворов приведены в табл. 3.1. [c.80] Органы растений, из которых берут эксплант для введения в культуру, предварительно моют щеткой в мыльном растворе и споласкивают дистиллированной водой, а затем погружают на несколько секунд в 70%-ный этанол. Семена погружают в спирт на 1—2 мин. Кроме собственно стерилизующего действия спирта обработка тканей этанолом перед помещением в основной стерилизующий раствор повышает стерилизующий эффект последнего. [c.80] После стерилизации растительные объекты должны быть тщательно промыты стерильной водой. [c.81] Поверхностная стерилизация освобождает эксплант только от наружной инфекции. Если же ткани экспланта имеют внутреннюю инфекцию, то его необходимо обработать антибиотиками. Особенно богаты внутренней инфекцией ткани тропических и субтропических растений с крупными сосудами. Загрязнение культур грибами или бактериями обычно выявляется через 1—14 дней после посадки. Загрязненные культуры необходимо тотчас же удалить, чтобы избежать заражения воздуха в световой комнате. [c.81] Питательные среды стерилизуют в автоклаве при температуре 120°С и давлении 0,75—1 атм в течение 20 мин. Если в состав питательной среды входят вещества, разрушающиеся при высокой температуре, их подвергают холодной стерилизации, пропуская через бактериальные фильтры с диаметром пор 0,22—0,45 мкм, после чего добавляют в проавтокла-вированную охлажденную до 40°С основную среду. [c.81] Посуду, предварительно завернутую в фольгу или оберточную бумагу, стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при 160 С в течение двух часов. [c.81] Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям макроэлементы (азот, фосфор, калий, кальций, магний, серу, железо) и микроэлементы (бор, марганец, цинк, медь, молибден и др.), а также витамины, углеводы, фитогормоны или их синтетические аналоги. Некоторые питательные среды содержат гидролизат казеина, аминокислоты. Кроме того, в состав питательных сред входит ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или ее натриевая соль, которые улучшают доступность железа для клеток. [c.81] Для получения каллусной ткани в отдельных случаях к питательной среде добавляют жидкий эндосперм кокосового ореха (кокосовое молоко), каштана и др. [c.81] Углеводы являются необходимым компонентом питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей, так как в большинстве случаев последние не способны к автотрофному питанию. Чаще всего в качестве углевода используют сахарозу или глюкозу в концентрации 2—3 %. [c.81] Фитогормоны необходимы для дедифференцировки клеток и для индукции клеточных делений. Поэтому для получения каллусных тканей в состав питательных сред должны обязательно входить ауксины, вызывающие клеточную дедифференцировку, и цитокинины, индуцирующие деление клеток. В случае индукции стеблевого морфогенеза содержание ауксинов в среде может быть снижено или они могут быть полностью исключены из питательной среды. [c.81] На безгормональной среде растут опухолевые и привыкшие ткани. Автономность по отношению к обоим гормонам или к одному из них связана со способностью этих клеток синтезировать гормоны. [c.82] В качестве источников ауксинов в питательных средах используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), индолил-З-уксусную кислоту (ИУК), а-нафтилуксусную кислоту (НУК). Для получения рыхлого хорошо растущего каллуса чаще применяют 2,4-Д, так как ИУК почти в 30 раз менее активна, чем 2,4-Д. [c.82] В качестве источников цитокининов в искусственных питательных средах используют кинетин, 6-бензиламинрпурин (БАП), зеатин. 6-БАП и зеатин проявляют более высокую активность в поддержании роста изолированных тканей и индукции органогенеза по сравнению с кинетином. В состав некоторых сред входит аденин. [c.82] В настоящее время известно большое число различных по составу питательных сред, но наиболее часто применяемая при выращивании изолированных растительных тканей в условиях in vitro среда Т. Мурасига и Ф. Ску га, впервые составленная в 1962 г. Эта среда содержит хорошо сбалансированный состав питательных веществ и отличается от других, как правило, соотношением аммонийного и нитратного азота (табл. 3.2). [c.82] Для приготовления твердых питательных сред используют агар-агар, который представляет собой полисахарид, получаемый из морских водорослей. [c.82] С целью рационального использования времени растворы солей мак-ро- и микроэлементов, а также витаминов и фитогормонов готовят более концентрированными, что позволяет многократно их использовать. Концентрированные (маточные) растворы хранят в холодильнике. [c.82] Условия культивирования. Для успешного культивирования изолированных клеток и тканей растений необходимо соблюдать определенные условия выращивания. Большинство каллусных тканей не нуждается в свете, так как не имеют хлоропластов и питаются гетеротрофно. Исключение составляют некоторые зеленые каллусные ткани, такие, как каллусная ткань мандрагоры. В некоторых случаях каллусные ткани, не способные к автотрофному питанию, все же выращивают на непрерывном освещении, что является необходимым условием дальнейшего успешного морфогенеза, как у люцерны. Большинство же каллусных тканей получают в темноте или при рассеянном свете. [c.82] Детерминированные к морфогенезу ткани переносят на свет и далее культивируют их при освещенности 1000—4000 лк. [c.82] Оптимальная температура для большинства культивируемых тканей 25— 26 С, для культуры тканей тропических растений она может достигать 29—30°С. В случае индукции морфогенеза температуру понижают до 18—20 С. [c.83]

Вернуться к основной статье

www.chem21.info


Смотрите также